周红杰1,李家华1,赵龙飞1,韩俊1,杨行吉2,杨伟2,吴新庄3

       （现代）普洱茶是以云南大叶种制成的晒青毛茶作为原料，经发水、渥堆、陈化及干燥工序精制而成的后发酵茶，产于（现代）云南的西双版纳、思茅、临沧和下关等地。渥堆是普洱茶品质的形成最为关键一道的工序。普洱茶选用云南大叶种为原料，经特殊的加工工艺制成，外形条索肥硕壮实，色泽褐红（俗称“猪肝色”）或带灰白色，汤色红浓明亮，滋味醇和回甘，具有独特陈香的品质特征。

       根据陈宗道[2]研究发现普洱茶渥堆过程中存在有黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉、酵母等微生物，黑曲霉约占微生物总数的80%左右。胡建程[3.4]等先后在各种再加工茶中分离鉴定出青霉（Penicllium）、曲霉（Aspergillium）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、蜡中枝孢霉（Cladosprium）等。并且经研究发现在渥堆前期中温型霉菌生长繁殖迅速，后期低温嗜干的灰绿曲霉开始繁殖。并有酶系活动，使内含成分发生了深刻的变化。罗龙新[5]等研

       究了云南普洱茶渥堆过程中主要的生化成分及水浸出物等含量的变化，其结果表明，茶叶中的主要生化成分均随渥堆时间延长而剧烈变化。至渥堆结束时，茶多酚、儿茶素、TF、TR、氨基酸和可溶性糖含量均剧烈的下降；TB和水不溶性茶多酚则明显增加，但水浸出物含量并未明显下降，说明茶叶中内含物质通过氧化、降解、缩合等反应已产生新的色香味成分。这些成分的剧烈变化，除了湿热作用外，微生物的参与起到了关键的作用。本文针对云南普洱茶渥堆过程中主要微生物与品质形成关系的研究，旨在科学揭示云南普洱茶提供一定的理论依据。

1. 研究材料和仪器

1.1 研究材料

       试验材料的选择：昆明市西山区德顺茶厂的临沧镇康毛茶、潮水发酵生产的茶样（第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶、出堆茶）；试验室内模拟大生产发酵生产的第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶、出堆茶；经紫外灭菌处理发酵生产的第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶、出堆茶的茶样作为试验材料。

       培养基的选择：分离曲霉类的培养基（PDA培养基）、黑曲霉纯化培养基、分离酵母的培养基（麦氏培养基）、分离细菌的培养基。

1.2 主要仪器设备

       MISK 15型电冰箱、WS/08-01型调温调湿箱、766型红外线辐射干燥箱、LX-600型超级微型高速离心机、OLY-MPUS摄影显微镜、UV-240PC联机紫外分光光度计、超净工作台、PHS-2型酸度计、METTLER AE163数显电子天平

2. 实验方法

2.1 曲霉类、酵母、细菌的分离、鉴定和计数

       样品稀释液的制备[6];培养基的配制及灭菌[7];接种[8];选菌及纯化[9];载片培养;显微观察及显微摄影;微生物的计数[10]

2.2. 感官审评：聘请长期从事茶叶审评的教师采用茶叶感官审评方法（SB/T10157-1992）进行审评，根据普洱茶的特殊性，同一样品连续冲泡审评三次。

3. 结果与分析

3.1 普洱茶渥堆茶样中的主要微生物

       黑曲霉（Aspergillium niger）是一种低等真核生物，属于半知菌亚门（Deuteromycotina）；曲霉属（Aspergillus）[11]。世界公认它的安全可食用性，在工业生产和学术研究中占有重要的地位。作为参与普洱茶品质形成的重要菌种，研究其生命周期及其代谢产物变化有着重要意义。
                        
       普洱茶加工中的黑曲霉（Aspergillium niger）菌落在PDA培养基上生长迅速，在28~30°C下培养3d直径一般大约为47~63mm，少数菌株生长较局限，多数生长较快，菌落平坦或中心稍凸起，有规则或不规则的辐射状沟纹，质地丝绒状或稍呈絮状，有的菌偶有过度生长，分生孢子大量，表面呈暗褐色至炭黑色，渗出液有或无；有的菌株产生菌核，在平面培养基上生于中央，在斜面上多生于基部，菌落反面无色、黄色、黄褐色或带微黄绿色，初生为球形至辐射形，直径150~470 mm。老后分裂成几个圆柱形，可达780mm左右。

       黑曲霉在生产中具有重要的经济意义。可用于食品工业生产柠檬酸和其它有机酸，同时可资利用许多酶，如糖苷酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、柚苷酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶[11]等。且它的变异菌株可产生柠檬酸、葡萄糖酸、草酸及抗坏血酸。在普洱茶发酵渥堆过程中黑曲霉代谢产生的有机酸和酶对普洱茶品质的形成无疑也有着重要的作用。

3.1.2 青霉属（Penicillium）青霉大多数种在生活史中只具有无性阶段，属于半知菌亚门（Deuteromycotina）；丛梗孢科（Moniliaceae），仅少数种部分有性阶段[12]。普洱茶渥堆试验中主要有常见青霉和普通青霉出现。

       常见青霉（Penicillium frequentans）菌落青绿色，地毯状，有时色淡，分生孢子球形和亚球形，分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，单个细胞球形或卵圆形，暗蓝色，背面呈橙褐色或墨绿色，小梗7~9 3 3.5mm,分生孢子直径大约2.3~3.1um，光滑，该种青霉能产生柠檬酸霉素[12,13]。

       产黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌落蔓延，周围分泌黄色液，蓝绿色至亮绿色背面黄色，后变为褐色，分生孢子梗直径2.8~3.6um菌株形状为帚状枝，分生孢子以椭圆形为主。该种霉菌是能产生青霉素的一种霉菌[14]，在乳制品、面包、肉制品、果实、蔬菜等有机物中最常见，广泛用于医药。

       在普洱茶渥堆过程中青霉产生多种酶类及有机酸，可生产葡萄糖氧化酶或葡萄糖酸、柠檬酸、柠檬酸霉素和抗坏血酸。并且，青霉素发酵中的菌丝废料含有丰富的蛋白质、矿物质和B类维生素；产黄青霉代谢产生的青霉素对杂菌、腐败菌可能有良好的消除和抑制生长作用，因此，对普洱茶醇和品质的形成可能有辅助作用。

3.1.3 根霉属（Rhizopus）属于接合菌亚门（Zygomycotina）毛霉科（Mucoraceae）[15]。除了细菌以外，根霉是迄今为止丝状菌中产L乳酸的另一重要菌种[15]。

       普洱茶中分离的菌落营养体在培养基上呈白色，绒毛状，葡萄菌丝弓状弯曲在与培养基表面相接处产生假根，假根发达，分枝多，两节间距离大约为1~2um，孢囊梗直立不分枝，孢子囊球形或椭圆形褐色或黑色，囊轴球形、椭圆形，直径约为55um，高约70um。根霉其淀粉酶的活力很高，能产生有机酸，还能产生芳香的酯类物质，也是转化甾醇族化合物的重要菌类，在普洱茶加工中生成一定数量的根霉，有利于普洱茶甜香品质的形成。但由于分泌果胶酶能力强，渥堆中根霉的滋生会造成普洱茶茶叶软化，甚至腐烂。所以，普洱茶渥堆中的每个阶段，控制好中温中湿的环境，提高根霉菌的比例，有利于普洱茶粘滑和醇厚品质的形成。

3.1.4 灰绿曲霉（Aspergillium gloucus）属于半知菌亚门（Deuteromycotina）；曲霉属（Aspergillus）

       普洱茶中分离的菌落呈灰绿色或黄绿色，营养菌丝有些会含有红色至橙色的颗粒，子囊壳黄色至橙色，小梗单层，分生孢子椭圆形至亚球形，在28~30°C培养3~4天可长到1.20~1.70cm左右大小，菌丝质地呈地毯状，菌落背面呈乳黄色、黄褐或橙褐色，该菌种会使食品腐烂变质。试验表明：普洱茶加工中控制堆温、改善制茶环境卫生可减少该菌群的滋生，有利于纯正普洱茶品质的形成。

3.1.5 酵母属（Saccharomyces）是普洱茶品质形成的重要菌种

       酵母菌是一种单细胞微生物，属于真菌类。其营养细胞为圆形、卵形或长圆形；光亮、粘稠、易挑取；在培养基表面，不深入到培养基内部；扁平光滑；子囊孢子圆形、卵形和肾形等。酵母含有极丰富的蛋白质，具有人体所必需的八种氨基酸、B族维生素、维生素D2原、脂肪、粗纤维素、碳水化合物、矿物质及微量元素等，同时还含有丰富的酶系统,（如蔗糖酶、麦芽糖酶等）和生理活性物质（如辅酶Ⅰ、辅酶A[17]等），而且，酵母菌还能利用多种糖类代谢产生维生素B1、B2，维生素C[1]。此外，酵母在保健功能上，可以健脑、健胃、美容、解酒、预防肝坏疽，改善肝脏功能和延缓衰老。在普洱茶渥堆过程中控制数量得当，可以增加普洱茶中的有效营养物质以及对人体有保健作用的物质。且有利于形成普洱茶甜、醇香等品质风格。但是，如果控制不当，则会形成辣、刺、叮、麻、挂、锁、酸等不利的物质，影响和降低普洱茶的品质。

       在普洱茶渥堆过程中除上述几种微生物外，还有土曲霉、白曲霉、少量的细菌和极少量未检出的微生物。结合不同处理普洱茶渥堆过程中的主要微生物变化和品质的变化分析得出：普洱茶制作过程中微生物的菌种变化是极其复杂的，有的微生物自始至终对普洱茶品质形成发挥着积极的作用，有的微生物是在普洱茶加工的某一阶段发挥着形成普洱茶独特风格的作用，有的微生物则不利于普洱茶品质的形成。

       在普洱茶大生产中黑曲霉>酵母>青霉>根霉>灰绿曲霉>细菌>土曲霉>白曲霉；而在普洱茶模拟试验中黑曲霉>酵母>根霉>青霉>灰绿曲霉>细菌>土曲霉>白曲霉；并且在灭菌试验中黑曲霉>酵母>根霉>青霉>白曲霉>土曲霉>灰绿曲霉>细菌。从以上三个不同处理比较分析可知，无论是大生产试验、还是模拟试验、灭菌试验，黑曲霉数量始终处于优势地位，酵母菌的总数居次，细菌数目极少，没有发现有致病细菌。这与中山大学对广东普洱茶渥堆过程中微生物群落的分析结果相一致，这是各种微生物之间拮抗作用的结果。又由于霉菌能利用各种多糖作为碳源，进行糖代谢，产生大量的双糖和单糖，当酵母和霉菌大量繁衍，抑制了细菌的生长[18]。同时也与国内外研究表明茶多酚与人或动物致病密切相关的几个类群细菌有较显著的抑制作用相一致。这表明茶叶在渥堆的过程中，由于湿热作用，为微生物的活动和代谢创造了良好的环境，同时也给茶叶的化学成分变化提供了热源，加强了酶系活动。微生物所分泌的酶对茶叶内含成分的各类物质发生的物理化学变化产生极大的作用。可见，良好普洱茶具有的甘滑、醇厚、活顺、陈香等品质特点与黑曲霉和酵母在普洱茶渥堆中主从优势有密切的关系。因此，它们的变化对普洱茶品质的形成有着重要的意义。

       在普洱茶加工过程中，无论是大生产、还是模拟试验和灭菌试验，其渥堆过程中茶叶品质随着发酵深度，汤色、香气、滋味、叶底都发生了深刻的变化。汤色由黄绿色变为红浓明亮，香气由纯正的清香变为浓厚的醇香或带樟香气，滋味由苦涩变为醇和回甘，

       叶底由晒青黄绿变为棕褐柔软。分析表明，这些品质特点与普洱茶在渥堆过程中微生物因子是分不开的。

       在微生物参与下的酶促作用和湿热作用，茶多酚的氧化、缩合、蛋白质和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的分解以及各产物之间的聚合、缩合等一系列反应，生成更加复杂的对普洱茶品质有利的物质，如茶多酚的氧化产物和衍生物等呈色物质和呈味物质。从而使色泽黄绿、滋味纯正尚涩、香气清鲜纯正的晒青毛茶转为色泽红褐、滋味醇和回甘、香气陈醇的普洱茶[18]。在模拟试验渥堆过程中始终没有嗅到异样的气味，而灭菌渥堆试验的普洱茶不仅汤色略深于大生产和模拟试验，而且到渥堆的后期出现了樟香的气味。从而推知，灭菌试验生产普洱茶在改善品质方面有特殊意义。

4 讨论

4.1 普洱茶品质形成的重要因子是微生物

       黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉、酵母、土曲霉、白曲霉和细菌等在普洱茶的加工中，直接和间接的参与了普洱茶品质形成的作用，其中黑曲霉最多，酵母菌其次，它们是普洱茶渥堆过程中制约和影响普洱茶品质的重要菌种。因此，从普洱茶加工过程中的原料入手，研究分析普洱茶渥堆过程中微生物的特征特性是揭示普洱茶品质形成机理的核心内容。

4.2 微生物生命活动和代谢产物是普洱茶品质形成的重要因子

       在普洱茶渥堆过程中，初期主要霉菌有黑曲霉、青霉、根霉、毛霉、灰绿曲霉、及酵母，中后期以黑曲霉和酵母为主。黑曲霉能产生20种左右的水解酶[5]，其中葡萄糖淀粉酶、纤维素酶和果胶酶，可以分解包括有多糖、脂肪、蛋白质、天然纤维、果胶和不可溶性水化合物等有机物。水解产物大多为单糖、氨基酸、水化果胶和可溶性碳水化合物。是形成普洱茶甘滑、醇厚的物质基础。同时，酵母菌代谢产生有机酸、人体需要的氨基酸、维生素、生理活性物质以及它本身的内含物质，在对人体健康和保健方面赋予普洱茶较其它茶类有独特疗效的品质特点。在普洱茶加工中由于黑曲霉和酵母菌占优势，对其它种类微生物产生的拮抗作用，使其在中后期逐渐减少，这些微生物仍然对普洱茶品质形成起到直接或间接的作用。所以说，微生物代谢产生的酶和呼吸代谢产生的热量及湿热作用的协同条件下形成了普洱茶特有甘滑、醇厚等品质特征。

       普洱茶加工中的微生物具有产生氧化酶的特性（代替多酚氧化酶作用），能有效的引起多酚类物质的变化。在渥堆过程中，普洱茶侵染和滋生大量微生物，由于温度、湿度、PH值等条件适应其生长繁殖、进行生长发育。微生物本身含有的酶和微生物代谢产生的多种胞外酶，如多酚氧化酶、过氧化物酶，坏血酸氧化酶活性有较大幅度的增加，其中多酚氧化酶活性与发酵过程中黑曲霉的消长呈高度正相关。此外，还有纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶活性在发酵初期均不明显，在中后期活性增加。这些酶使茶的内含物发生了复杂的变化，对普洱茶品质的形成有极其重要的作用。由此可见，微生物在云南普洱茶品质形成中起决定性的作用，是普洱茶品质形成的重要因子。